【edgeRの使い方】発現変動遺伝子の検出

次世代シーケンサーを用いてRNA-Seq解析を行うとそれぞれの遺伝子の発現量が得られます。 複数のサンプルの遺伝子発現量の定量結果をもとに、グループ間比較を行うことで発現変動遺伝子の検出が行われます。

本ページでは、発現変動遺伝子を検出するソフトウェアであるedgeRの使い方やインストール方法を解説します。

以下の操作が難しいと感じる場合には、WEB上で簡単に発現変動遺伝子を検出できるツールも公開しておりますので、是非ご利用ください。

まずはじめに R がない場合には、R をインストールします。(Homebrewを使ったインストール例です。)

Rを起動して、以下を実行して BiocManager および edgeR をインストールします。

以下を実行して、エラーが表示されなければインストール成功です。

featureCountsやStringTie、RSEMといったソフトウェアを用いて、遺伝子発現量の定量結果を取得します。

最終的に以下のようなカンマ区切りファイル（CSVファイル）としてデータを整理しました。 edgeRに入力するファイルはFPKM/RPKMやTPMのように補正したデータではなく、生のリードカウント結果であることに注意してください。

カウントデータを読み込んで、グループの情報と合わせてDGEListオブジェクトを作成しました。 今回は、sample1~4とsample5~8の2群比較を行いたいので、AとBの2群に分けました。

filterByExprを用いて発現の少ない遺伝子をフィルタリングしました。 この例では、遺伝子数が35,627から14,698に減少しました。

calcNormFactorsを用いてサンプル間のバイアスを補正するためのTMM正規化を実施しました。

最後に、quasi-likelihood F-testsを実施します。

発現変動遺伝子が抽出できました。logFCについてはこちらで解説しています。 logCPMのCPMはCounts Per Millionを意味します。

以下で、FDR < 0.05の行を抽出できます。

FDRはFalse Discovery Rateの略です。FDR < 0.05で抽出した場合には、抽出された遺伝子の中で実際には変動していない遺伝子(偽陽性)の割合が5%ととなります。

TMM正規化とはRNA-Seq解析における遺伝子発現量の補正方法の１つで、edgeRに実装されている手法です。

RNA-Seqで測定できるのは、絶対的な発現量ではなく相対的な発現量です。 そのため、少ない遺伝子がたくさん発現している場合に、相対的に他の遺伝子の発現量が減少したように見えてしまいます。 そこでTMM正規化では、サンプル間の発現量の違いを最小化するように補正を行います。 この方法を用いれば、サンプル間で大部分の遺伝子の発現が変動していないデータであれば妥当な補正を行えることになります。

なお、TMM正規化ではサンプル間で共通の要素については補正を行いません。 例えば、遺伝子長はリードカウントに相関すると言われており、遺伝子長が長いほどリードカウントは多くなりますが、TMM正規化では補正していません。 edgeRでは発現変動遺伝子の抽出にフォーカスしており、遺伝子間の補正は必要ありませんので、TMM正規化で十分です。

一方で、FPKM/RPKMやTPMといった正規化手法では遺伝子間の発現量を比較することも考慮して遺伝子長に対する補正も行っています。